蛋白定量是科研和临床检验工作中常用的基本技术，定量与否对疾病诊断及实验研究至关重要。现有蛋白浓度测定试剂盒的方法有很多，如BCA法、Lowry法、Bradford法等，都各有其优点。其中Bradford 法具有成本低、灵敏度高和测定快速简便的特点，是目前应用广泛的蛋白质定量方法之一。有研究就应用Bradford法来测鹿茸、牛奶、阿莫西林等等其中的蛋白质含量。
本篇应用通过简单的Bradford法进行微量蛋白的测定，用实验来给大家介绍我们奥谱天成NanoBio200超微量分光光度计在试剂盒上的应用。
Bradford法的原理：
Bradford试剂蛋白定量是一种快速，即用型的总量蛋白光学定量方法，在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致吸收峰由 465nm变为595nm，同时颜色由棕色变为蓝色，该蓝色化合物的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA与Bradford试剂混合，测量在595nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。
标准蛋白浓度的建立：
1、取一定量的BSA蛋白质标准液(5mg/ml)，用1×PBS稀释为终浓度为1mg/ml，做标准测定时倍比稀释。
2、取7支2ml离心管，1号管为试剂空白， 2-7管分别加牛血清白蛋白10、20、40、60、80、100ul, 各管均以PBS 定量至100ul。
溶液管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
1×PBS(ul) | 100 | 90 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
1mg/mlBSA(ul) | 0 | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
BSA浓度（ul/ml） | 0 | 100 | 200 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
3、各加入1ml Brandford工作液，迅速混匀。
4、置室温等待反应5min，测定吸光度A (波长点595nm )。
5、打开NanoBio200试剂盒法模块，选择标准曲线列表，检测类型：Bradford-595，添加，创建曲线。
6、输入样品浓度，点击检测，曲线拟合，系统自动以标准蛋白浓度为x轴，A值为y轴作标准曲线
结论：应用Bradford法，以BSA蛋白绘制标准曲线，蛋白质浓度与吸光度呈线性关系，R2=0.996。
样品测试：
在做标准蛋白定量的同时，取3支2ml试剂管加入待测蛋白溶液100ul(这边有目的性新配了三个浓度800、500、200ug/ul)，加入1ml Brandford工作液，迅速混匀。等待反应5min，利用建模的标准线来测试蛋白样品的浓度。做重复测试，计算其标准差和CV值。
表2 待测蛋白溶液测试结果及稳定性表
浓度ug/ml | 800 | 500 | 200 |
平均值ug/ml | 798.79 | 504.50 | 207.70 |
标准差ug/ml | 1.21 | 4.50 | 7.70 |
CV% | 1.1% | 3.1% | 4.8% |
结论：由表2结果可知，重复性均良好，CV值在<5.0%。
总结：
蛋白-染料复合物在595nm处检测并在750nm处做基线校正。可以从多个厂家购买相应的试剂盒。每一个试剂盒都会标配Bradford试剂以及标准蛋白，根据其说明书进行标准溶液的配备，用我们的NanoBio200试剂盒法模块建模即可，样品检测后的 A595值应在标准曲线范围内，如若超出此范围，则需将样品酌情稀释或浓缩。由于不同蛋白光吸收值各不相同，因此如果能用目的蛋白做标准曲线可得到更加准确的结果。
本次实验只是简单示范。从图4我们可以很直观的得出待测样品的浓度，使用NanoBio200超微量分光光度计，操作简单方便，仪器自带7寸显示屏，单机操作，数据和可直接通过U盘导出，将成为在任何实验室环境下进行蛋白质测量和分析的理想选择。